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MLST:醫(yī)院鑒定病原菌分型的必備方法!
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Original: https://www.sohu.com/a/607760615_121618669

摘要:

本文建立了金黃色葡萄球菌多位點序列分型的方法(MLST)。從英國牛津地區(qū)社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性侵襲性疾病患者的155株金黃色葡萄球菌分離株中獲得了7個持家基因的內部片段序列。本文共鑒定出53個不同的等位基因圖譜,其中17種由至少兩種分離株代表。MLST方案具有很高的區(qū)分性,并通過脈沖場凝膠電泳顯示具有相同等位基因分布的分離株對產(chǎn)生非常相似的SmaI限制性片段模式來驗證。所有22個等位基因分布最普遍的等位基因均為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離株(MRSA),其等位基因譜與流行性MRSA克隆16(EMRSA-16)的參考菌株相同。還鑒定了四個MRSA分離株,其等位基因與英國醫(yī)院流行的其他主要流行MRSA克隆(克隆EMRSA-15)相同。大多數(shù)分離株(81%)為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌分離株(MSSA),7個MSSA克隆包括5個或更多分離株。三個MSSA克隆包括至少五個來自社區(qū)獲得性侵襲性疾病患者的分離株,可能代表毒性克隆,在其他健康個體中導致疾病的能力增加。最流行的MSSA克?。?7個分離株)與EMRSA-16密切相關,后者在醫(yī)院引起疾病的成功可能是因為它是從一個致命的MSSA克隆中出現(xiàn)的,該克隆已經(jīng)是社區(qū)和醫(yī)院侵襲性疾病的主要原因。MLST提供了一種明確的方法,用于通過互聯(lián)網(wǎng)將MRSA和MSSA分離株的方法分配給已知克隆,或者將它們的方法分配給新的克隆。

綜述:

金黃色葡萄球菌是一種主要病原體,與嚴重的社區(qū)獲得性和醫(yī)院內疾病相關。在英國,金黃色葡萄球菌是僅次于大腸桿菌的血液培養(yǎng)物中第二常見的分離物,也是迄今為止最常見的醫(yī)院獲得的生物體。與嚴重疾病相關的臨床綜合征包括細菌血癥、肺炎、心內膜炎、感染性關節(jié)炎、骨髓炎和深部膿腫形成。

在前抗生素時代,侵襲性金黃色葡萄球菌病的死亡率很高,青霉素的引入對治療產(chǎn)生了巨大影響。半合成青霉素-甲氧西林于1959年被引入,以克服因青霉素酶產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌對青霉素G和青霉素V產(chǎn)生耐藥性而引起的問題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株在20世紀60年代在歐洲和70年代在美國及其他地方迅速出現(xiàn)并成為醫(yī)院內的主要臨床問題。許多耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株對大多數(shù)其他種類的抗菌劑都有耐藥性,并且只對糖肽和新的研究藥物敏感。最近關于MRSA對糖肽(糖肽-中間金黃色葡萄球菌)易感性降低的報道威脅著我們進一步損害了我們治療醫(yī)院獲得性金黃色葡萄球菌感染的能力。

盡管MRSA和GISA引起的感染控制問題以及有限的治療選擇是醫(yī)院主要關注的問題,醫(yī)院內要求的大多數(shù)金黃色葡萄球菌感染和社區(qū)內要求的幾乎所有金黃色葡萄桿菌感染都是由對甲氧西林和大多數(shù)其他類別抗生素敏感的菌株(甲氧西林敏感金黃色葡萄菌 [MSSA] )引起的。很少有研究對MSSA分離株進行了表征,目前尚不清楚在社區(qū)(或醫(yī)院)中流通的某些MSSA克隆是否具有導致嚴重感染(高毒克?。┑奶厥饽芰?,并具有國際分布。我們也不了解這一重要致病基因的種群和進化生物學的基本特征。

如果我們能夠明確地描述金黃色葡萄球菌的分離株,就可以回答關于金黃色葡萄桿菌種群生物學的許多基本問題,以及更好地理解MRSA克隆的起源和傳播,以及不同實驗室描述的MRSA和MSSA克隆的相關性。研究MRSA的本地和全球流行病學最廣泛使用的分子分型方法是脈沖場凝膠電泳(PFGE)。該方法已被證明在醫(yī)院爆發(fā)的調查中非常成功,并已被用于識別具有引起重大暴發(fā)和在國內和國際傳播的特殊能力的MRSA克?。餍行訫RSA克隆;EMRSA)。PFGE和所有依賴于比較凝膠上DNA片段模式的方法的一個主要缺點是很難比較不同實驗室的結果。因此,對于不同實驗室所描述的EMRSA克隆的遺傳相關性存在相當大的困惑,迫切需要一種方法,該方法允許在不需要交換參考菌株的情況下明確識別EMRSA和強MSSA克隆。

多基因座序列分型(MLST)是一種高度區(qū)分的方法,可根據(jù)以下序列來鑒定細菌分離物:7個持家基因的450bp內部片段。對于每個基因片段,不同的序列被指定為不同的等位基因,每個分離物由七個持家基因座(等位基因譜或序列類型 [ST])中的每個等位基因定義。由于7個基因座中的每一個都有許多等位基因,分離株極不可能偶然具有相同的等位基因譜,具有相同等位基因圖譜的分離株可以被指定為同一克隆的成員。序列數(shù)據(jù)很容易在實驗室之間進行比較,MLST的一個主要優(yōu)點是能夠通過互聯(lián)網(wǎng)比較不同研究中獲得的結果。此外,MLST獲得的數(shù)據(jù)可用于解決有關細菌物種進化和種群生物學的基本問題。

MLST已被開發(fā)用于鑒定腦膜炎奈瑟菌的致病譜系,并將肺炎鏈球菌菌株標記為主要的高毒力克隆和主要的青霉素耐藥和多重抗生素耐藥克隆。在本報告中,我們描述了金黃色葡萄球菌MLST方案的開發(fā)和驗證,并通過鑒定來自嚴重社區(qū)需求和醫(yī)院獲得性感染患者的155個最近分離株中的MRSA和MSSA克隆,證明了該方法的實用性。

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材料和方法

細菌分離物

我們從1997年或1998年在英國牛津地區(qū)發(fā)現(xiàn)的侵襲性金黃色葡萄球菌病患者中選擇了155個連續(xù)的細菌分離物。侵襲性金金色葡萄球菌病被定義為在具有與金黃色葡萄桿菌感染相一致的臨床體征和癥狀的患者中,從正常無菌部位分離出有機體。排除了與假體材料相關的深度局部感染患者的分離物,以及僅從一個血培養(yǎng)瓶(至少兩個已接種的)中分離出金黃色葡萄球菌的敗血癥患者的分離。根據(jù)臨床細節(jié)將患者分為兩組:社區(qū)獲得性疾病組和醫(yī)院獲得性疾病患者。社區(qū)獲得性疾病被定義為與侵襲性金黃色葡萄球菌病一致的疾病,需要入院治療,并導致在入院24小時內從正常無菌場所采集的樣本中分離出金黃色葡萄桿菌。此外,在過去6個月內因任何原因住院的患者被排除在這一類別之外。155株分離株中,61株來自社區(qū)獲得性疾病患者,94株來自醫(yī)院獲得性疾病。140個分離物來自血液培養(yǎng)物,另外15個來自侵襲性金黃色葡萄球菌病患者的深膿樣本。通過陽性管凝固酶和DNase測試,證實分離物為金黃色葡萄球菌。通過測量生物的苯唑西林MIC來測定對甲氧西林的耐藥性。這是通過使用苯唑西林E試驗(AB Biodisk,Solna,Sweden)完成的,其耐藥性定義為2ug /ml的最低抑菌濃度。

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MLST

14個管家基因的DNA序列由SmithKline Beecham的M.Burnham提供。用BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.cgi)將它們的基因產(chǎn)物與EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,并對肺炎球菌蛋白及其同源物的氨基酸序列進行比對,確定最具變異區(qū)。利用多變區(qū)兩側高度保守區(qū)的序列設計了引物。每對引物都擴增了管家基因的一個內部片段(約500bp),并對兩條鏈上每個基因的450bp片段進行了測序。

在最終的MLST方案中使用了以下7個管家基因,并使用表1所示的引物擴增了這些片段:氨基甲酸激酶(ARCC)、莽草酸脫氫酶(ARE)、甘油激酶(GLP)、鳥苷酸激酶(GMK)、磷酸乙酰轉移酶(PTA)、磷酸丙糖異構酶(TPI)和乙酰輔酶A乙酰轉移酶(YqiI)。


染色體DNA的提取采用Jordan和Pennington的方法,但在細胞裂解階段加入終濃度為30g每毫升的溶葡萄球菌酶(Sigma)對該方法進行了改進。采用50ul反應體積,包含0.5uL的染色體DNA(約0.5ug)、0.5ug的每個引物、1U的TaqDNA聚合酶(英國的Qiagen,Crawley)、5ul的10X緩沖液(與Taq聚合酶一起提供)和0.2 mM脫氧核苷三磷酸鹽(Perkin-Elmer應用生物系統(tǒng)公司,加利福尼亞州福斯特城)。聚合酶鏈式反應在PTC-200DNA引擎(MJ Research,波士頓,馬薩諸塞州)中進行。首先在95℃變性5分鐘,然后在55℃1分鐘,72℃延伸1分鐘,95℃變性1分鐘,最后72℃延伸5分鐘,30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用20%聚乙二醇-2.5M氯化鈉沉淀擴增產(chǎn)物,再懸浮在冷的70%乙醇中并再沉淀;并用ABI Prism 377 DNA測序儀和BigDye熒光終止劑以及初始PCR擴增中使用的引物測定兩條鏈的序列。

對于每個基因座,比較了從所有155個分離株獲得的序列,并為不同的序列分配了等位基因編號。對于每個分離株,七個位點中的每個位點的等位基因定義了與其ST相對應的等位序列。通過使用Sta-tistica(StatSoft,Tulsa,Okla.)從分離株等位序列之間的成對差異百分比矩陣中使用算術平均數(shù)(UPGMA)通過未加權對組方法實現(xiàn)分離株的聚類。通過Sawyer的方法檢查了每個基因片段序列上可變位點分布的非隨機性。通過使用序列輸出(一種Macintosh程序,可從MLST網(wǎng)站獲得)顯示多態(tài)位點 (http://mlst.zoo.ox.ac.uk).。

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PFGE

金黃色葡萄球菌的染色體DNA在瓊脂糖塊中制備,并通過Bannerman等人的方法用SmaI切割。(2)樣品在0.5% TBE緩沖液(44.5mM Tris,44.5mM硼酸鹽,1mM EDTA)中的1%瓊脂糖凝膠上,在CHEF DR-III PFGE系統(tǒng)(Bio-Rad,Hemel-Hampsted,Herts-fordshire,United Kingdom)上運行,初始切換時間為1s,持續(xù)12小時,然后使用6V cm的電壓,初始切換速度為15s,持續(xù)30秒。(3)使用串聯(lián)噬菌體λDNA(新英格蘭Biolabs,馬薩諸塞州貝弗利)來提供分子大小標記。

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MecA的檢測

通過使用引物MR1和MR2來確定mecA的存在,引物用于PCR以擴增基因的1339bp內部片段。在95℃、55℃和72℃下分別進行1min、1min和2min的30個循環(huán)PCR實驗。

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核苷酸序列登錄號

本研究中使用的7個基因座的每個等位基因的DNA序列已在GenBank中保存,編號為:AJ252295-2310、AJ271251-89、AJ271387-403和AJ271482-510,可從上述網(wǎng)站下載。

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結果

這七個管家基因片段的序列

對來自不同地理位置的10個金黃色葡萄球菌菌株的14個管家基因片段進行了測序,并選擇了提供最多等位基因的7個基因片段用于MLST方案。然后對牛津郡地區(qū)侵襲性疾病患者最近分離的155株金黃色葡萄球菌的這7個管家基因片段進行了測序,它們的長度在402到516個核苷酸之間(表2)。對于每個分離株,將七個基因座中的每一個獲得的序列與其他分離株的序列進行比較,并對等位基因進行連續(xù)編號。序列被指定為不同的等位基因,即使它們在單個核苷酸位點上不同;沒有應用加權來反映等位基因之間核苷酸差異的數(shù)量。


每個基因座存在11個等位基因(glpF和gmk)和17個等位基因(arcC和aroE)(表2),每個基因座平均有14.4個等位基因,這允許區(qū)分>100×106個ST。金黃色葡萄球菌基因相對一致;七個位點的多態(tài)核苷酸位點的數(shù)量在13(gmk)和23(aroE)之間變化。圖中顯示了兩個最均勻和兩個最多樣的基因片段內的多態(tài)性位點。圖1序列的目視檢查表明,每個基因片段的多態(tài)性位點分布是隨機的,Sawyer所述的試驗證實了這一點。



金黃色葡萄球菌MLST方案的驗證

表3顯示了155株金黃色葡萄球菌分離株中鑒定的53種不同等位基因或ST。MLST方案通過從包含多個分離株的17個ST中選擇一對分離株并通過PFGE檢查從每對染色體DNA獲得的SmaI片段的相似性來驗證。對于包括MRSA和MSSA分離物的ST12和22,選擇的一對是MRSA,一對是MSSA。8對分離物的SmaI PFGE指紋如圖所示。圖2對分離株(ST34)中的一對具有5個片段差異,但其他對(包括由MRSA和MSSA分離株組成的兩對)在4個片段或更少的片段上存在差異。

根據(jù)MLST數(shù)據(jù)構建的樹狀圖,似乎相對密切相關的ST分離株之間也觀察到SmaI片段模式的相似性(圖3)。例如,ST30和34(5個或6個片段差異)、ST30和36(2到5個片段的差異)以及ST45和49(4到7個片段的不同)的分離株通過PFGE顯示出明顯的相似性(圖2)。相比之下,在樹狀圖上看似遠親的ST分離株顯示出大量片段差異。例如,通過MLST,ST25和30在所有7個位點上具有不同的等位基因,ST39和45在7個位點中的6個位點上不同(表3); 通過PFGE,這兩對ST的分離物之間至少有20個片段差異(圖2)。

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侵襲性金黃色葡萄球菌分離株的聚類。

圖3顯示了由155個分離株的等位基因譜之間的成對差異矩陣構建的樹狀圖。ST36含有最多的分離株,其中22株均為MRSA。第二大簇是ST30。ST30的17個分離株均為MSSA,并且在基因型上與ST36的MRSA分離株密切相關,因為它們的等位基因型僅在一個位點(pta)不同。其他9種ST由至少5種分離株代表。除ST36(僅包括醫(yī)院獲得的MRSA分離株)外,所有11種流行的ST均以從社區(qū)獲得性感染患者和醫(yī)院獲得性感染的患者中回收的分離株為代表。

11個流行ST中的9個是克隆復合物的一部分,其中包括流行ST的分離株和密切相關的分離株,其等位基因圖譜僅在單個位點與流行ST的圖譜不同(圖3;表3)。在三種情況下,克隆復合體包括更多的STS,其等位基因圖譜僅在一個兩個座位上彼此不同(圖3;表3)。例如,STS 29至38的分離株(見下文)是一個大聚集群的一部分,該集群包括155個分離物中的48個(31%),其中包括兩個主要的STS。類似地,STS 44至48和STS 14至18分別包括14個和10個密切相關的分離株。

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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分離株分析

155株細菌中,29株(19%)耐甲氧西林,126株(81%)耐甲氧西林。只有一株MRSA分離株是從一名社區(qū)獲得性感染患者那里獲得的。本研究確定的主要克隆(ST36)包括22株MRSA分離株。其中11株MRSA被提交給中央公共衛(wèi)生實驗室(Colindale,倫敦,英國),并被PFGE指定為EMRSA-16克隆的成員。EMRSA-15和EMRSA-16是近年來在英國醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的最常見的MRSA克隆。確定了中央公共衛(wèi)生實驗室的B.Cookson提供的EMRSA-15(菌株90/10685)和EMRSA-16(菌株96/32101)參考菌株的等位基因圖譜。EMRSA-16參考菌株的等位基因圖譜與ST36的22株MRSA分離株的等位基因圖譜相同。

類似地,EMRSA-15參考菌株的等位基因圖譜與ST22的分離株相同。ST22包括四個MRSA分離株,包括收集的唯一一個是社區(qū)獲得的,以及四個MSSA,其中三個是社區(qū)獲取的。

只有三個MRSA分離株不屬于ST36(EMRSA-16)或ST22(EMRSA-25)。其中兩個分離株(屬于ST35和ST38)與EMRSA-16非常密切,因為它們僅在一個基因座上不同,并且被認為是EMRSA-116的小變體。另一個MRSA分離株(屬ST12)與四個MSSA分離株的集群無法區(qū)分,并且與我們檢查的MRSA克隆的任何參考菌株都不相似。

對包括MRSA和MSSA分離物的兩個ST的所有分離物(STs 12和22)以及至少兩個含有MRSA分離物其他ST的成員測定mecA的存在。所有測試的MRSA分離株均含有mecA基因,而MSSA分離株中未檢測到該基因。

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甲氧西林金黃色葡萄球菌分離株分析

本次調查中收集到的大多數(shù)侵襲性金黃色葡萄球菌分離株(126株;81%)均為甲氧西林敏感株,它們占所有社區(qū)獲得性感染的98%和所有醫(yī)院獲得性感染中的70%。在收集的155個分離株中,有60個社區(qū)獲得的MSSA分離株和66個醫(yī)院獲得的MSSB分離株。

大多數(shù)MSSA分離株(71%)具有與至少一個其他MSSA分離物相同的等位基因譜,17個ST中有14個包含完全由MSSA分離體組成的多個分離物。醫(yī)院獲得的和社區(qū)獲得的MSSA分離株之間沒有明顯差異。由至少三種MSSA分離物代表的所有11種ST均包含來自醫(yī)院獲得性感染患者和社區(qū)獲得性感染的患者的分離物(圖。(圖3).3)。分離物最多的MSSA克隆包含17個(ST30)、12個(ST25)、8個(ST8和ST39)和7個(ST1和ST5)分離物,占本研究MSSA分離物的47%。

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英文原文:

Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1008-15. doi: 10.1128/JCM.38.3.1008-1015.2000. PMID: 10698988; PMCID: PMC86325.


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