你想了解嗎，哪些腸道菌群在胖子中增加，瘦子中減少？
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本文為了闡明胖、瘦如何影響腸道菌群的問題，收集單卵、雙卵雙胞胎的成年女性，以及她們的母親的糞便樣本，利用了二代高通量測序技術(shù)進行了16S rRNA測序。分析了154個人的9920條近全長的16S rRNA序列和1937461條16SrRNA的序列部分，和2.14G的微生物基因組的數(shù)據(jù)后，本文發(fā)現(xiàn)家庭成員共享腸道菌群，但每個人在單獨的腸道菌群中有所不同，與此同時，成年單卵、雙卵雙胞胎間菌群共同變異的程度相當。在每人不同腸道菌群海量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，依然找了“核心菌群”。胖、瘦與“核心菌群”的門級變化、“核心菌群”多樣性降低以及“核心菌群”基因、代謝途徑表達的改變這四個因素直接相關(guān)。
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實驗方法總結(jié)
收集154個人的糞便樣本。制備DNA，以用于454生命科學的二代高通量測序和16S rRNA基因的PCR反應和測序。使用以下5個數(shù)據(jù)：NCBI Non-redundant、KEGG、STRING、CAZY、44人腸道菌群基因組數(shù)據(jù)庫，將Reads映射到參考基因組。注釋以下3個數(shù)據(jù)庫CAZy、KEGG和STRING用來重構(gòu)代謝。相對豐度的KEGG代謝通路被作為“代謝譜”。
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實驗結(jié)果
我們研究了31對單卵（MZ）雙胞胎、23對雙卵（DZ）雙胞胎及其母親（n=46）的腸道微生物群落。進行了單卵雙胞胎配對、雙卵雙胞胎配對、父母-后代配對的方案，用來評估基因型、早期環(huán)境共享這兩個因素對腸道菌群的影響。此外，可重復的方式因過度喂養(yǎng)而增加體重9對遺傳上“相同”的單卵雙胞胎、雙卵雙胞胎、無親緣關(guān)系的人，單卵雙胞胎BMI體重指數(shù)的增加最一致， DZ雙胞胎次之、無親緣關(guān)系的人最不一致。
本研究招募了密蘇里州青少年女性雙胞胎研究（MOAFTS）的雙胞胎對（MOAFTS的平均注冊期為11.7±1.2年；范圍為4.4–13.0年）。所有雙胞胎年齡均為25-32歲，具有歐洲或非洲血統(tǒng)（分別為EA和AA），通常與肥胖（BMI≥30 kg/m2）或消瘦（BMI=18.5–24.9 kg/m2）[1對雙胞胎為消瘦/超重（超重定義為BMI≥25和<30），6對超重/肥胖]，且至少5.49±0.09個月未服用抗生素。每個參與者都完成了一份詳細的醫(yī)療、生活方式和飲食問卷：他們在體重指數(shù)、生育率、教育程度和軍事狀況方面廣泛代表了密蘇里州的總體人口（見補充結(jié)果）。盡管所有人都出生在密蘇里州，但他們目前居住在美國各地：29%的人住在同一棟房子里，但有些人居住的距離超過800公里。由于糞便樣本很容易獲得，并且代表了腸道微生物生態(tài)學中的人際差異，因此從每個人身上收集糞便樣本并立即冷凍。再次重復采集程序，平均采樣間隔為57±4天。
為了研究這154個人糞便微生物群中存在的細菌譜系，我們用ABI 3730xl毛細管測序儀對全長基因進行了16S rRNA測序。此外，我們使用454 FLX儀器進行多重焦測序，以調(diào)查基因的V2可變區(qū)和V6高變區(qū)。
使用互補的系統(tǒng)發(fā)育和分類法比較糞便群落中的16S rRNA序列（見方法）。無論檢查基因的哪個區(qū)域，來自同一家族的個體（雙胞胎及其同卵雙胞胎，或雙胞胎及其母親）的細菌群落結(jié)構(gòu)都比不相關(guān)的個體更相似（圖1A和補充圖1A，B），并且共享明顯更多的物種級門型（定義為共享≥其16S rRNA序列的同源性為97%）[G=55.2，p<10?12（V2）；G=12.3，p<0.001（V6）；G=11.3，p<0.001（全長）]。家庭成員當前家庭的物理分離程度與其微生物群落之間的相似程度（由UniFrac定義）之間沒有顯著相關(guān)性。觀察到的家族相似性不是由于肥胖與消瘦的生理狀態(tài)的間接影響；通過BMI分類對雙胞胎及其母親進行分層后，觀察到了類似的結(jié)果（一致的瘦或一致的肥胖個體；補充圖2）。令人驚訝的是，成人MZ與DZ雙胞胎的腸道微生物群相似程度沒有顯著差異（圖1A）。然而，在本研究中，我們無法評估MZ和DZ雙胞胎在其生命早期是否有不同程度的相似性。
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與一代測序相比，V2和V6擴增子的多重焦測序允許更高水平的覆蓋，平均每個樣本達到3984±232（V2）和24786±1403（V6）序列。為了控制覆蓋率的差異，所有分析均在相同數(shù)量的隨機選擇序列上進行 [200個全長、1000個V2和10000個V6] 。在這一覆蓋水平上，采樣的糞便群落之間幾乎沒有重疊。此外，糞便微生物群中屬于每個門的16S rRNA基因序列的數(shù)量差異很大（補充表6-8）。
由于這種明顯的重疊缺失可能反映了覆蓋水平（補充表1-3），我們隨后使用基于標準泊松和二項抽樣統(tǒng)計組合的抽樣模型搜索了所有宿主中存在高豐度的細菌門型。通過分析，我們可以得出結(jié)論，在本研究的所有樣本中，沒有任何種類的豐度超過0.5%（見補充結(jié)果）。最后，我們通過隨機選擇50–3000個序列/樣本對數(shù)據(jù)集進行二次采樣；同樣，在該覆蓋范圍內(nèi)采樣的所有個體中均未檢測到任何門型（補充圖3）。
在最初采集點和57±4天后從同一個人身上采集的樣本與發(fā)現(xiàn)的特定菌門一致（補充圖4、5），但主要腸道細菌門的相對豐度存在差異（補充圖6）。UniFrac距離與樣本采集時間之間沒有顯著關(guān)聯(lián)?？傮w而言，來自同一個人的糞便樣本比來自家庭成員或無關(guān)個人的樣本更相似（圖1A），表明與個人間差異相比，個人內(nèi)社區(qū)結(jié)構(gòu)的短期時間變化較小。
對三種基于PCR的方法產(chǎn)生的16S rRNA數(shù)據(jù)集進行分析，再加上DNA的shotgun測序（見下文），結(jié)果顯示，與瘦EA和AA個體相比，肥胖個體中的擬桿菌屬比例較低，放線菌屬比例較高（補充表9）。使用Fisher方法結(jié)合這些獨立分析中的單個p值，發(fā)現(xiàn)擬桿菌明顯較少（p=0.003），放線菌較多（p=0.002），但厚壁菌無顯著差異（p=0.09）。這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究一致，即當12名不相關(guān)的肥胖人在攝入兩種低熱量飲食中的一種后體重減輕時，小鼠的兩種分類群的差異相當，擬桿菌屬的代表性逐漸增加。
在所有方法中，肥胖與多樣性水平的顯著降低相關(guān)（圖1B和補充圖1C–F）。這種多樣性的減少表明了一個類比：肥胖的腸道微生物群不像雨林或珊瑚礁，它們適應高能量通量，高度多樣性，而可能更像肥料徑流，其中多樣性減少的微生物群落在異常能量輸入下開花。
隨后，我們通過shotgun pyrosequencing測序（補充表4、5）和BLASTX比對多個數(shù)據(jù)庫[KEGG和STRING]以及一個自定義數(shù)據(jù)庫，對代表6個家族的18個個體（3個瘦EA-MZ雙胞胎對及其母親加上3個肥胖EA-MZ雙對及其母親）的糞便微生物群的微生物譜系和基因含量進行研究44個參考人類腸道微生物基因組（補充圖7-10和補充結(jié)果）。我們的分析參數(shù)使用由KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋的隨機片段微生物基因組成的對照數(shù)據(jù)集進行了驗證（補充圖11和補充方法）。我們還測試了產(chǎn)生更長讀數(shù)的技術(shù)進步如何通過使用Titanium pyrosequencing方法對一對雙胞胎的糞便群落樣本進行測序來改善這些分配[平均讀數(shù)長度為341±134 nt（SD），而標準FLX方法為208±68 nt]。補充圖12顯示，序列分配的頻率和質(zhì)量隨著讀取長度從200 nt增加到350 nt而提高。
搜索18個微生物組，以確定與實驗驗證的碳水化合物活性酶組（CAZymes）的結(jié)構(gòu)域相匹配的序列。在至少一個人體腸道微生物組中發(fā)現(xiàn)了與156個總CAZy家族相匹配的序列，包括77個糖苷水解酶、21個碳水化合物結(jié)合模塊、35個糖基轉(zhuǎn)移酶、12個多糖裂解酶和11個碳水化合物酯酶家族（補充表10）。平均而言，腸道微生物組中2.62±0.13%的序列可歸屬于CAZymes（共217615個序列），這一比例大于最豐富的KEGG途徑（“轉(zhuǎn)運蛋白”；1.20±0.06%的每個樣本產(chǎn)生的過濾序列），并表明大量多樣的微生物基因可用于獲取廣泛的多糖。
使用主成分分析（PCA）和分層聚類對每個微生物組的功能進行了基于類別的聚類。根據(jù)代謝概況，確定了兩個不同的腸道微生物組群，分別對應于厚壁菌門和放線菌門豐度增加的樣本和擬桿菌門豐度高的樣本（圖2A）。第一主成分（PC1，解釋了20%的函數(shù)方差）和擬桿菌屬相對豐度的線性回歸顯示出高度顯著的相關(guān)性（R2=0.96，p<10?12; 圖2B）。在積累了約20000個序列后，每個個體的微生物組內(nèi)的功能分布穩(wěn)定（補充圖13）。家庭成員比無關(guān)個體具有更多相似的特征（圖2C），這表明共享的細菌群落結(jié)構(gòu)（基于16S rRNA分析）也轉(zhuǎn)化為共享的全社區(qū)代謝途徑的相對豐度。因此，功能和分類相似性的直接比較（見補充方法）揭示了一個重要的關(guān)聯(lián)：具有相似分類特征的個體也具有相似的代謝特征（p<0.001；Mantel檢驗）。
代表分配給23個人類腸道厚壁菌門和14個擬桿菌門參考基因組的微生物組讀數(shù)的全門序列箱的功能聚類顯示了按門的離散聚類（補充圖14A，15）。對微生物組來源的厚壁菌門和擬桿菌門序列庫中代謝途徑相對豐度的Bootstrap分析揭示了具有顯著不同相對豐度的26條途徑（補充圖14A）。擬桿菌門富含多種碳水化合物代謝途徑，而厚壁菌門富含運輸系統(tǒng)。該發(fā)現(xiàn)與我們的CAZyme分析一致，該分析揭示了擬桿菌序列庫中糖苷水解酶、碳水化合物結(jié)合模塊、糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶的相對豐度顯著較高（補充圖14B）。
國際人類微生物組項目的主要目標之一是確定在所有或絕大多數(shù)人類的特定身體棲息地中是否存在可識別的共享生物、基因或功能能力的“核心微生物組”。盡管所調(diào)查的18個腸道微生物組中，相對于細菌門的相對豐度，對廣泛功能類別基因（COG）和代謝途徑（KEGG）的相對豐度的分析揭示了一個總體一致的模式，無論調(diào)查的樣本如何（圖3B和補充表11）：該模式也與我們從先前發(fā)表的9個成人腸道微生物組數(shù)據(jù)集的薈萃分析中獲得的結(jié)果一致（補充圖16）。這種一致性不僅僅是由于這些注釋的廣泛程度，因為對擬桿菌門和厚壁菌門參考基因組的類似分析揭示了每個類別的相對豐度的顯著差異（參見補充圖17）。此外，本研究中從18個微生物組獲得的代謝譜的成對比較顯示平均R2為0.97±0.002（圖2A），表明功能相似性較高。
使用Shannon index對總體功能多樣性進行了比較，Shannon index結(jié)合了多樣性（不同類型代謝途徑的數(shù)量）和均勻性（每個途徑的相對豐度）。所調(diào)查的人體腸道微生物組具有穩(wěn)定且高的Shannon指數(shù)值（4.63±0.01），接近功能多樣性的最大可能水平（5.54；見補充方法）。盡管存在少量豐富的代謝途徑（列于補充表11），但每個腸道微生物組的總體功能分布相當均勻（香農(nóng)均勻度為0.84±0.001，比例為0至1），表明大多數(shù)代謝途徑的豐度水平相似。有趣的是，每個微生物組的功能多樣性水平與擬桿菌的相對豐度顯著相關(guān)（R2=0.81，p<10?6); 富含厚壁菌門/放線菌的微生物群具有較低水平的功能多樣性。這一觀察結(jié)果與對36個擬桿菌屬和厚壁菌屬基因組中每一個產(chǎn)生的模擬宏基因組讀數(shù)的分析一致（補充圖18）：平均而言，擬桿菌屬基因組具有顯著更高的功能多樣性和均勻性水平（Mann-Whitney，p<0.01）。
在更精細的水平上，26-53%的“酶”級功能組（KEGG/CAZy/STRING）在所有18個微生物組中共享，而8-22%的功能組是單個微生物組獨有的（補充圖19A–C）。所有微生物組中存在的“核心” 功能組也非常豐富，占總序列的93–98%。鑒于這些“核心”組的相對豐度較高，在從給定的微生物組中采集26.11±2.02 Mb序列后，發(fā)現(xiàn)>95%，而“可變”組隨著每增加一Mb序列繼續(xù)顯著增加。當然，對核心微生物組總大小的任何估計都將取決于測序工作，特別是對于低豐度的功能組。平均而言，我們的調(diào)查每個糞便樣本獲得了450000多個序列，假設(shè)分布均勻，這將允許我們對相對豐度為10?4.為了估計基于18個個體的核心微生物組的總大小，我們在1000個序列間隔內(nèi)對每個微生物組進行了隨機亞采樣（補充圖19D）?；谶@一分析，核心微生物組接近總共2142個同源組（一個位點結(jié)合雙曲線曲線與所得到的稀疏曲線擬合，R2=0.9966），表明我們已識別出18個受調(diào)查個體的核心微生物組中發(fā)現(xiàn)的93%的功能組（由STRING定義）。在這些核心組中，71%（CAZy）、64%（KEGG）和56%（STRING）也出現(xiàn)在之前發(fā)表的9個由成人糞便DNA毛細管測序生成的覆蓋率低得多的數(shù)據(jù)集中（平均78413±2044個雙向讀數(shù)/樣本；見補充方法）。
“核心”微生物組的代謝重建揭示了許多預期功能類別的顯著富集，包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能類別（圖4）?；诖x譜的聚類表明，“核心”功能組的表達在樣本中高度一致（補充圖20），并包括許多可能對腸道生活很重要的途徑，如碳水化合物和氨基酸代謝（如果糖/甘露糖代謝、氨基糖代謝和N-甘氨酸降解）?？勺兇淼耐緩胶皖悇e包括細胞運動（只有厚壁菌門的一部分產(chǎn)生鞭毛）、分泌系統(tǒng)和膜運輸（例如，參與營養(yǎng)物質(zhì)（包括糖）輸入的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；圖4和補充圖20）。
比較了每對微生物組中CAZy糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶家族的分布（相對豐度>1%的CAZy家族見補充表10）。該分析表明，所有個體的糖基轉(zhuǎn)移酶譜都相似（R2=0.96±0.003），而糖苷水解酶譜的變異性更大，即使在家族成員之間也是如此（R2=0.80±0.01；p<10?30，配對學生t檢驗）。這表明糖苷水解酶的數(shù)量和光譜可能比糖基轉(zhuǎn)移酶更受飲食等“外部”因素的影響。
為了確定與肥胖相關(guān)的代謝途徑，在比較瘦雙胞胎和肥胖雙胞胎的腸道微生物組時，只包括非核心相關(guān)（可變）功能組。自舉分析用于確定在可變肥胖腸道微生物組中富集或耗竭的代謝途徑。例如，與飲食誘導肥胖的小鼠模型相似，肥胖的人體腸道微生物組富含參與碳水化合物微生物加工的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（補充表12）。將所有腸道微生物組序列與44個人類腸道基因組的定制數(shù)據(jù)庫進行比較：優(yōu)勢比分析顯示，肥胖和瘦腸道微生物組之間有383個基因顯著不同（q值<0.05；肥胖微生物組中273個基因富集，110個基因缺失；補充表13、14）。相比之下，只有49個基因在所有雙胞胎中持續(xù)富集或缺失（見補充方法）。
這些肥胖相關(guān)基因代表了上述的分類差異：75%的肥胖富集基因來自放線菌（與0%的貧富集基因相比，其余25%來自厚壁菌門），而42%的貧富集的基因來自擬桿菌門（與0%肥胖富集基因相比）。他們的功能注釋表明，許多參與碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸代謝（補充表13、14）。它們共同構(gòu)成了肥胖腸道微生物組的一組初始微生物生物標志物。
我們發(fā)現(xiàn)，成年MZ雙胞胎對的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與DZ雙胞胎對的相似程度相當，與母親相比僅略為相似，這與早期對成年雙胞胎的指紋研究以及最近基于微陣列的分析一致，這表明，與12個不相關(guān)的嬰兒相比，一對DZ雙胞胎在出生后第一年的腸道群落聚集遵循更為相似的模式。有趣的是，另一項對MZ和DZ雙胞胎兒童的指紋研究顯示，DZ雙胞胎的相似性略有降低，以及對其家族微生物群的代際分析，將是確定宿主基因型和環(huán)境暴露對（腸道）微生物生態(tài)的相對貢獻的關(guān)鍵。
假設(shè)有一個核心的人類腸道微生物組，可以由我們共同擁有的一組豐富的微生物-生物譜系來定義，這一假設(shè)可能是錯誤的：到成年時，在所有154個采樣的人類的腸道中，沒有一個單一的細菌門型以豐富的頻率被檢測到。相反，似乎核心腸道微生物組存在于代謝功能水平。這種保護表明腸道微生物組存在高度冗余，并支持將每個個體視為“島嶼”的生態(tài)觀點，“島嶼”上居住著獨特的微生物種類群：與實際島嶼一樣，不同的物種組合匯聚在由不同組成部分提供的共享核心功能上。我們的發(fā)現(xiàn)提出了一個問題，即核心功能是如何在這個身體棲息地中組裝的。了解這些基本原理應該能提供關(guān)于微生物適應各種環(huán)境的見解，也許還可以提供在大范圍環(huán)境中的互惠共生的群落集合。
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英文原文
Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T, Cantarel BL, Duncan A, Ley RE, Sogin ML, Jones WJ, Roe BA, Affourtit JP, Egholm M, Henrissat B, Heath AC, Knight R, Gordon JI. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 2009 Jan 22;457(7228):480-4. doi: 10.1038/nature07540. Epub 2008 Nov 30. PMID: 19043404; PMCID: PMC2677729.
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