人類蛋白質(zhì)之間的相互作用圖為更好地理解蛋白質(zhì)組的功能組織提供了一個(gè)有價(jià)值的框架。為了系統(tǒng)地檢測人類蛋白質(zhì)的相互作用對，通過自動酵母雙雜交系統(tǒng)篩選了4456個(gè)baits和5632個(gè)preys的蛋白質(zhì)矩陣。研究者在1705種蛋白質(zhì)中鑒定出3186種主要是新的相互作用，形成了一個(gè)大的、高度連接的網(wǎng)絡(luò)。單獨(dú)的Pull-down和共免疫沉淀試驗(yàn)保證了酵母雙雜交相互作用的總體質(zhì)量。使用Topological和GO criteria開發(fā)了一個(gè)評分系統(tǒng)，用來定義401種蛋白質(zhì)之間的911種高置信度的相互作用。系統(tǒng)的人類蛋白質(zhì)之間的相互作用對蛋白質(zhì)功能和細(xì)胞過程有更全面的理解。

高置信度的人類蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

研究者專門從數(shù)據(jù)中提取了一個(gè)高可信度相互作用網(wǎng)絡(luò)，如下圖所示。研究者使用GO和OMIM標(biāo)準(zhǔn)將蛋白質(zhì)分為三大類：疾病蛋白質(zhì)（45）、非特征蛋白質(zhì)（49）和已知蛋白質(zhì)（307）。對于45種疾病蛋白，鑒定了163種高可信度蛋白-蛋白相互作用（表S1）。這些信息可作為疾病特異性調(diào)查的資源。

如下圖所示，大多數(shù)蛋白質(zhì)（87%）是連接的，并形成一個(gè)大的相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，獲得了24個(gè)含有少于6個(gè)蛋白質(zhì)的小網(wǎng)絡(luò)。

涉及401個(gè)通過911個(gè)相互作用連接的蛋白質(zhì)的高置信度相互作用網(wǎng)絡(luò)。橙色：疾病蛋白；淺藍(lán)色：GO注釋的蛋白質(zhì)；黃色：無GO和疾病注釋的蛋白質(zhì)。顏色編碼線表示連接節(jié)點(diǎn)的交互：綠色：3 quality points；藍(lán)色：4 quality points；紅色：5 quality points；紫色：6 quality points。

涉及401個(gè)通過911個(gè)相互作用連接的蛋白質(zhì)的高置信度相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

實(shí)驗(yàn)步驟

人cDNA在酵母雙雜交載體中的亞克隆

從5‘端對hEx1文庫的9665個(gè)cDNAs進(jìn)行測序，以確定每個(gè)片段的同源性和閱讀框架。對NR (NCBI) 或tembl (Swiss-Prot) 數(shù)據(jù)庫的BLASTP分析顯示，通過限制性克隆將4275個(gè)cDNA插入酵母雙雜交質(zhì)粒pGAD426和pBTM117c中，這是一組非冗余的cDNA。從RZPD文庫的源克隆中擴(kuò)增出2136個(gè)人全長ORF片段，并將其克隆到pDONR201中。用BLASTP搜索對重組克隆進(jìn)行測序和注釋。通過重組克隆，將基因片段穿梭到酵母雙雜交載體pBTM116-D9和pGAD426-D3中。矩陣中克隆的冗余度小于4%，即編碼相同蛋白質(zhì)不同部分的克隆?？傮w而言，48%的質(zhì)粒編碼全長ORF，而52%的質(zhì)粒編碼更大的人類蛋白質(zhì)的C端片段。

自動的酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選

為了創(chuàng)建相互交配的矩陣，用獵物質(zhì)粒（編碼Gal4激活域融合）分別轉(zhuǎn)化L40ccαMATα酵母菌株（Goehler等人，2004）；將所得酵母克隆排列在384孔微量滴定板中。同時(shí)，將誘餌質(zhì)粒（編碼LexA DNA結(jié)合域融合）引入L40ccU MATa菌株中，并組裝在96孔板中。在與表達(dá)AD蛋白的MATα菌株交配后激活HIS3、URA3和lacZ報(bào)告基因的誘餌（19.6%）被排除在自動酵母雙雜交分析之外。

為了進(jìn)行交互交配，使用移液機(jī)器人在384孔MTP中復(fù)制5μl MATα酵母菌株的液體培養(yǎng)物，培養(yǎng)并與40μl匯集的MATa菌株（八個(gè)誘餌）混合。然后使用定點(diǎn)機(jī)器人將酵母混合物轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD瓊脂平板上，并在30°C下孵育36小時(shí)。交配后，克隆自動從平板上摘下，并轉(zhuǎn)移到含有SDII（-Leu-Trp）液體培養(yǎng)基的384孔MTPs中。為了選擇蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，將二倍體酵母點(diǎn)在SDIV（-Leu Trp Ura His）瓊脂板上，以及放置在SDIV瓊脂板上的尼龍膜上。在30°C下孵育5-6天后，使用軟件Visual Grid評估瓊脂平板和尼龍膜的數(shù)字化圖像，以確定其生長和β-半乳糖苷酶活性。

為了確認(rèn)相互作用，將每個(gè)池中的八個(gè)誘餌排列在96孔MTP中，并與第一個(gè)交配屏幕中確定的陽性獵物交配。在30°C下36小時(shí)后，將酵母培養(yǎng)物置于SDII瓊脂板上，以選擇表達(dá)兩種蛋白融合的二倍體細(xì)胞。在30°C下4天后，在SDIV瓊脂平板和尼龍膜上測定酵母菌落。

膜免疫提純和Pull-down實(shí)驗(yàn)

為了表達(dá)血凝素和蛋白A標(biāo)記的融合蛋白，將與酵母雙雜交相同的片段分別亞克隆到PTL-HA或pcDNA3.1-PA中，并成對共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。用十二烷基硫酸鈉-PAGE和免疫印跡分析兩種蛋白的表達(dá)，并用96孔斑點(diǎn)印跡儀篩選(約3μg蛋白提取物)。洗膜6次，用抗HA單抗12CA5檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。

在體外下拉實(shí)驗(yàn)中，將cDNA片段亞克隆到pQE30-NST或PTL-HA中。分別從大腸桿菌和COS-1細(xì)胞中制備His標(biāo)記融合蛋白和HA標(biāo)記融合蛋白的可溶性蛋白提取物。His標(biāo)記的融合蛋白與Ni2+NTA瓊脂糖珠結(jié)合(約30μg蛋白)。洗滌后(50 mM HEPES-KOH[pH 7.4]，300 mMNaC l，1%NP-40，5 mM咪唑，1 mM DTT)，在4℃下與含有潛在相互作用的HA標(biāo)記融合蛋白的200μg COS-1細(xì)胞提取物孵育2小時(shí)。洗滌后，用SDS-PAGE和抗HA抗體免疫印跡分析結(jié)合蛋白。

熒光素酶實(shí)驗(yàn)

LEF/Tcf報(bào)告基因分析如前所述，并進(jìn)行如下修改：用脂質(zhì)體將0.125、0.25和0.5μg的所指示的ANP32A或CRMP1載體和0.5μg DVL表達(dá)載體與TOP或?qū)φ誇OP熒光素酶報(bào)告基因和β-半乳糖苷酶載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在1.25μg質(zhì)粒DNA中加入空載體DNA。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后測定熒光素酶活性，并與β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行對照。采用三重轉(zhuǎn)染法進(jìn)行報(bào)告分析。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用圖的計(jì)算分析

使用LL.out_hs（NCBI），通過BLASTP在nr（NCBI）或tembl（Swiss-Prot）數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的登錄號，將蛋白質(zhì)定位到一個(gè)唯一的基因位點(diǎn)。酵母雙雜交克隆的BLAST分析和用InParanid程序計(jì)算的與預(yù)測的黑腹葡萄球菌、線蟲和釀酒酵母蛋白質(zhì)組的正交學(xué)分配如表S2所示。從HPRD獲得了4478個(gè)蛋白質(zhì)之間14384個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的人類參考集。對于相互作用簇的分配，我們參考了完整的黑腹葡萄球菌酵母雙雜交數(shù)據(jù)集(20439個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；6991個(gè)蛋白質(zhì))，線蟲WI5數(shù)據(jù)集(5534個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；3227個(gè)蛋白質(zhì))，以及來自釀酒酵母的人工挑選的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用目錄(8946個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；4525個(gè)蛋白質(zhì))。使用TopNet進(jìn)行拓?fù)浞治?，例如度分布、聚類系?shù)和路徑長度。NCBI Loc2Go和OBO注釋GO功能，KEGG數(shù)據(jù)注釋通路。

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英文原文

Stelzl U, Worm U, Lalowski M, et al. A human protein-protein interaction network: a resource for annotating the proteome. Cell. 2005.